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Hablando con Científicos

El conocimiento científico crece gracias a la labor de miles de personas que se esfuerzan, hasta el agotamiento, por encontrar respuestas a los enigmas que plantea la Naturaleza. En cada programa un científico conversa con Ángel Rodríguez Lozano y abre para nosotros las puertas de un campo del conocimiento.

CRISPR, biotecnología del siglo XXI. Hablamos con Jorge Laborda

CRISPR - Hablando con Científicos podcast - CienciaEs.com

Como habíamos prometido en un programa del podcast Ciencia Fresca, hoy hemos elaborado un programa especial de “Hablando con Científicos” dedicado a la tecnología CRISPR. El invitado es Jorge Laborda, catedrático de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Castilla-La Mancha en Albacete. Jorge explica, con todo lujo de detalles, la historia del descubrimiento y desarrollo posterior de esta tecnología que está revolucionando los laboratorios de genética de todo el mundo. A continuación les ofrecemos el texto que ha servido de guión para la entrevista, elaborado por el propio Jorge Laborda:

Ministerio de Ciencia e Innovación

Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología

Universidad de Castilla - La Mancha

CRISPR

Vamos a intentar explicar en el programa la revolución que está sucediendo en el área de la biología y genética moleculares con la tecnología CRISPR (crisper).

Lo primero que vamos a dejar claro es que CRISPR es hoy una tecnología muy prometedora para realizar de la manera más fácil que conocemos, lo que el ser humano lleva ya intentando hacer desde hace casi medio siglo: editar, modificar, “mejorar” los genomas de los seres vivos.

Para intentar comunicar la importancia de esta nueva tecnología vamos a dividir la conversación en tres partes: 1. Ciencia. 2. Tecnología 3. Presente y Futuro.

Ciencia.

¿Qué son los CRISPR?
Son regiones del ADN denominadas Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats (Repeticiones agrupadas capicúas espaciadas regularmente)
Se encuentran en los procariotas, no en los eucariotas.
Cada repetición de ADN se encuentra separada por una secuencia espaciadora diferente. Hay una secuencia de repeticiones idénticas de unas 30 letras separadas por fragmentos de ADN no repetitivos diferentes, de unas 36 letras cada uno.

El descubrimiento de esta estructura se atribuye a un español, Francisco Mójica, que trabaja en la Universidad de Alicante. En su trabajo de tesis doctoral Francisco Mójica analiza el genoma de una bacteria que vive en las salinas de Santa Pola, en Alicante, y resiste a altas concentraciones de sal.
Como la sal parece afectar a la manera en que los enzimas cortan y reparan el ADN de la bacteria, el director de Tesis de Francisco Mójica sugiere analizar modificaciones en el ADN que pudieran estar asociadas a estos cambios. Francisco Mójica, en sus análisis, descubre estas estructuras repetitivas, que son un misterio.
Tras la lectura de su tesis, el ya doctor Francisco Mójica se dedica a intentar revelar este misterio y averiguar para qué sirven estas oscuras repeticiones.
Lo primero que descubre es que esas repeticiones no se limitan a bacterias resistentes a altas concentraciones de sal, sino que se encuentran en bacterias comunes y también en las arqueas, otros procariotas que constituyen un reino de organismos unicelulares diferente.
La búsqueda de datos publicados en la época que Francisco Mójica realiza revela que un grupo japonés ya había descrito, en 1987, repeticiones similares en la bacteria más usada en el laboratorio, Escherichia coli, pero no habían continuado investigando su significado.
La presencia de estas repeticiones en procariotas muy diversos indica al Dr. Mójica que deben ejercer una importante función en esos organismos. ¿Cuál podía ser esta función?
El Dr. Mójica sigue investigando sobre este tema y logra también atraer la atención de otros laboratorios en varias partes del mundo. Para el año 2000, ha encontrado estas repeticiones en 20 especies de microbios, incluida la bacteria de la tuberculosis, la de la peste y Clostridium dificile, una bacteria causante de infecciones intestinales a veces muy severas.
Las investigaciones sobre estos microorganismos revelan que las repeticiones se encuentran cerca de un conjunto de genes que se denominan Cas, (por CRISPR-associated genes), los cuales se supone deben estar relacionados con su función.
Los análisis subsecuentes indican que los genes Cas parecen producir enzimas relacionados con el corte, degradación o unión de hebras de ADN.
Por esta razón, se propone la hipótesis de que las repeticiones CRISPR están involucradas en algún tipo de función de gestión del genoma bacteriano: regulación de la producción de proteínas, recombinación génica, reparación del ADN.
Todas esas hipótesis se revelan falsas. Gracias al análisis por bioinformática de las secuencias, y gracias a que las secuencias de varios microorganismos se van acumulando en los bancos de datos, el Dr. Mojica es capaz de comparar las secuencias de cada espaciador, es decir, las secuencias diferentes no repetidas de los locus CRISPR, con las acumuladas en bancos de datos genómicos.
Así, descubre que algunas de las secuencias espaciadoras de una cepa de bacteria E. coli son idénticas a las de algunos fragmentos de genoma de un bacteriófago que es un parásito común de esta bacteria: el bacteriófago P1.
Curiosamente, la cepa de bacteria E. coli que posee esta secuencia espaciadora es resistente a la infección por el bacteriófago.
Los análisis subsecuentes realizados por el Dr. Mojica revelan que la mayoría de las secuencias espaciadoras que encuentran un blanco en la base de datos de secuencias de ADN corresponden a secuencias de virus que atacan a las bacterias.
El Dr. Mójica se da cuenta así de que este sistema CRISPR es un sistema de defensa bacteriano frente al ataque de virus.
El Dr. Mójica tiene muchos problemas para publicar este hallazgo en una revista prestigiosa y finalmente lo publica en el Journal of Molecular Evolution en febrero de 2005, una buena revista, pero que no se encuentra entre las más influyentes ni prestigiosas.

Pero esta no es toda la historia. De manera independiente, un grupo francés de investigadores, dirigido por Gilles Vergnaud, descubre al analizar diferentes cepas de la bacteria de la peste que podrían ser usadas como armas bioterroristas, que los espaciadores del CRISPR provienen de virus y concluye igualmente que CRISPR es un sistema de defensa inmunológico contra estos microorganismos. Su publicación aparece en marzo de 2005, también en una revista de segunda línea.
Finalmente, otro investigador de origen ruso, que trabaja también en Francia, Alexander Bolotin, también publica en septiembre de 2005 que CRISPR es un mecanismo de inmunidad bacteriana, aunque la idea que propone para explicar cómo funciona este mecanismo se revelará más tarde falsa. Bolodin supone que CRISPR funciona como los RNA de interferencia, lo que no es el caso, como se sabe hoy.
A partir de estos estudios se comenzó a investigar también el papel de los enzimas cas, cuyos genes, como hemos dicho, se encontraban próximos a las repeticiones CRISPR.
Se fue descubriendo así que algunas enzimas cas se necesitan para la captura de ADN vírico y otras para la integración de este en el ADN bacteriano, en el locus CRISPR, y aún otras para actuar frente al ataque de los virus. Vamos, las bacterias contaban con una verdadera “caja de herramientas genética” para arrebatar información vírica y guardarla en su genoma, y luego usarla en contra del invasor, si este atacaba de nuevo.
Estos estudios proporcionaron evidencia experimental de que, en efecto, el sistema CRISPR era un sistema inmune adaptativo bacteriano.

Fue el laboratorio de Philippe Hovarth, interesado en mejorar el proceso de fermentación láctica en Estrasburgo, el que logró comprobar experimentalmente que bacterias cultivadas con virus adquirían resistencia a estos mediante la incorporación de espaciadores en el locus CRISPR. Además vieron que los virus que podrían superar esta resistencia eran los que habían mutado y ya no contenían secuencias de ADN absolutamente idénticas a la de los espaciadores capturados antes por las bacterias.
Otros laboratorios manipularon artificialmente el locus CRISPR de E. coli, le introdujeron una secuencia de un bacteriófago, y comprobaron que la bacteria se hacía así resistente al mismo.
Otras investigaciones demostraron que el sistema CRISPR actuaba atacando el ADN de los bacteriófagos o cualquier otro ADN extraño que pudiera entrar en la bacteria, si esta tenía espaciadores con secuencias idénticas a este. El ataque no se efectuaba al ARN, como sí sucedía en el caso de los ARN de interferencia, sino que era el ADN el que era atacado. Esta demostración se hizo modificando el ADN extraño, mutándolo, de manera que el ADN que se introducía en la bacteria fuera diferente, pero el ARN que producía fuera idéntico tanto si el ADN estaba mutado como si no. Esto se consigue introduciendo una secuencia en el ADN extraño que va a ser cortada y eliminada luego cuando este se transcriba a ARN. La bacteria enfrentada a ADN mutado perdía la resistencia, lo que demostró que el blanco de acción era el ADN, no el ARN.

Estos estudios demostraron que CRISPR funcionaba como un enzima de restricción programable.
Los enzimas de restricción son enzimas bacterianos que cortan el ADN. Son también sistemas de defensa frente a ADN extraño invasor, pero los enzimas de restricción son fijos, es decir, cortan solo secuencias de letras determinadas. El sistema CRISPR, en cambio, podía cortar en cualquier secuencia de ADN que fuera complementaria a uno de los espaciadores. Se podía programar para cortar lo que fuera necesario en todo momento.
Tras estos descubrimientos, las investigaciones se aceleran y hoy sabemos que existen al menos seis sistemas CRISPR diferentes en los procariotas, los cuales, al parecer, han podido evolucionar a partir de un sistema ancestral, o se ha podido igualmente desarrollar de manera independiente.

¿Cómo funcionan?

En primer lugar, cuando la bacteria es invadida por un virus, algunos enzimas cas capturan parte de su ADN, lo cortan en fragmentos e incorporan estos en el locus CRISPR, en orden, y separados cada uno por una repetición. Los fragmentos espaciadores son así ordenados en una especie de “estantería de secuencias de ADN externas”. Si la bacteria sobrevive a la infección (tal vez sus enzimas de restricción fijos puedan contenerla) ha capturado información valiosa sobre su invasor que podrá ser muy útil la próxima vez que se lo encuentre.
La bacteria genera a partir del ADN del locus CRISPR un RNA largo que contiene los espaciadores y las repeticiones. Diversos enzimas, dependiendo del sistema CRISPR de qué se trate y de la especie bacteriana, cortan a este ARN largo en fragmentos que contienen una pequeña porción de las repeticiones a izquierda y derecha de las secuencias espaciadoras, que son las que provienen de los virus y son complementarias al ADN de estos.
Estas secuencias cortas de ARN se unen a los enzimas cas y los guían hacia el ADN vírico que ha podido invadir a la bacteria, para cortarlo y degradarlo haciendo así la bacteria resistente a su ataque.
¿Vale cualquier secuencia de ADN de un bacteriófago o de ADN extraño como espaciador? No. En algunos sistemas CRISPR las secuencias válidas como espaciadores tienen que ser adyacentes a un triplete de letras llamado PAM (Protospacer Adjacent Motif), que es donde la nucleasa cas corta al ADN.
Es importante mencionar que la información que el virus arrebata a las bacterias, además, puede ser transmitida de generación en generación, ya que es información adquirida, pero es también información genética, y se trata, además, de organismos procariotas y, por tanto, unicelulares, que se reproducen por división celular y no cuentan con células especializadas para esa reproducción, como son las células germinales de organismos más complejos, como los animales y las plantas.

Tecnología

Una vez descubierta y entendida la ciencia, se puede ahora intentar usar este conocimiento para desarrollar una tecnología. CRISPR se suma a las tecnologías de edición y modificación de ADN que se han realizado hasta la fecha, pero tiene la ventaja de su sencillez y su alto rendimiento, es decir su eficacia.
Ahora explicaremos cómo se ha desarrollado esta tecnología, pero antes conviene mencionar que antes que CRISPR se han empleado diversas tecnologías para modificar el ADN de una célula, o para incorporarle o quitarle genes:
1. La transgénesis: incorporar genes nuevos en el genoma.
2. Los animales knockout: eliminación de genes del genoma.
3. Las transfecciones con ADN que se hace funcionar de manera autónoma en el interior celular.
4. Los ARN de interferencia, que se usan para disminuir la producción de proteína a partir de un gen concreto.
5. Las nucleasas de dedos de zinc.
6. Las nucleasas TALEN (transcription activator-like effector nuclease).
Todas estas técnicas tienen sus problemas, en particular que o bien no son fáciles de implementar, o bien no son muy eficaces, o bien causan cambios no deseados en el genoma que pueden falsear los resultados de investigación o crear inestabilidades genómicas que pueden invalidar una estrategia terapéutica, por ejemplo porque se aumenta el riesgo de transformación tumoral de una forma importante.
Afortunadamente CRISPR acude al rescate. El desarrollo de la tecnología CRISPR comienza estudiando el papel de varios de sus componentes.

El Dr. Virginijus Siksnys, lituano de nacimiento, en su trabajo en la universidad de Moscú, con su equipo, fue capaz de demostrar que la transferencia de un locus CRISPR de una especie de bacteria a otra confería a esta última resistencia a los mismos virus a los que era resistente la primera. Fue la primera demostración de que los enzimas CRISPR podían atravesar la barrera de las especies.
El mismo equipo fue poco después capaz de aislar, de purificar en el laboratorio, los componentes de un sistema CRISPR a partir de extractos de bacterias. Por su simplicidad, el sistema elegido fue el sistema cas9. Esto permitió analizar su actividad en el tubo de ensayo, es decir, in vitro, como se dice en lenguaje científico.
Así, estos investigadores pudieron demostrar que para cortar el ADN este sistema necesitaba de tres componentes: el enzima Cas9, un RNA corto correspondiente a un espaciador, que se llama RNA crispr o (crRNA) y que es el que es complementario a la secuencia del virus y un RNA corto de la misma secuencia de letras que las repeticiones CRISPR, que se llama tracrRNA. Ambos ARNs son necesarios para la actividad de cas9.
Los investigadores comprueban así en el tubo de ensayo que si añaden ARNs cortos de la secuencia que deseen correspondientes a los ARN de los espaciadores, pueden cortar el ADN de la misma secuencia.
Los estudios demuestran también que el corte en el ADN blanco lo realiza la proteína cas9, que tiene dos sitios de actividad, uno que corta una hebra de ADN y otro que corta la otra en un sitio cercano al primer corte.

Otro importante avance fue realizado por la doctora Emmanuelle Charpentier (la codescubridora del tracrRNA junto on Jorg Vogel), que trabaja en la Universidad de Viena, en colaboración con la Dra. Jennnifer Doubna, de la Universidad de California. Ambas científicas demostraron que el crRNA y el tracrRNA podían combinarse en un solo RNA fusionado y permitir aún así la actividad completa de cas9, que hasta el momento se suponía solo podía funcionar con dos RNAs separados. A este RNA fusionado se le denominó sgRNA (single-guide RNA).
Esto fue un gran avance para la tecnología. Con solo dos componentes, un RNA guía y el enzima cas9, los investigadores podían ahora cortar cualquier ADN de su elección.
¿Qué importancia tiene cortar el ADN donde se desee? Mucha.
Estudios anteriores en el campo de la biología molecular habían intentado desde casi el principio de esta disciplina editar los genomas de los microorganismos y células.
Los investigadores descubrieron que esta edición se ve muy favorecida si se consigue realizar un corte en el sitio del ADN que queremos modificar.
La razón de esto reside en que un corte en el ADN es interpretado por la célula como un daño que debe ser reparado. Esta reparación se produce de dos maneras: por recombinación homologa y por recombinación no homóloga.
La última es fácil de entender: los extremos cortados del ADN son unidos de nuevo mediante la intervención de enzimas reparadoras que añaden algunas letras como “pegamento” y unen los dos fragmentos rotos, aunque la información que contienen pueda haberse modificado. Esa modificación no es frecuentemente grave y permite a la célula segur viviendo y reproducirse, lo que difícilmente puede hacer con el ADN roto.
La recombinación no homóloga, si se lleva a cabo en millones de células a la vez en el laboratorio, siempre generará, por estadística, células con mutaciones que habrán inactivado al gen donde se ha realizado el corte. Es, por tanto, desde el punto de vista de la investigación, una manera de eliminar genes y de estudiar qué efectos produce esa eliminación.
Por otra parte, la recombinación homóloga solo se produce si la célula cuenta con otra copia de ADN no dañado que puede usar como molde para reparar el ADN dañado. Esto puede suceder durante la replicación de los cromosomas, por ejemplo.
En el caso de la edición del ADN con CRISPR, los investigadores pueden suministrar ese ADN homólogo a la célula, con la secuencia de su elección del sitio que debe ser reparado. Este ADN podrá sustituir al dañado por el corte justo en ese sitio.
La recombinación homologa, por tanto, es un medio de introducir cambios precisos en el ADN, al sustituir un ADN dañado por otro sano, que ha podido ser diseñado por los investigadores bien para reparar una mutación, bien para introducir una mutación nueva y ver qué efectos se producen.
Esta es la razón del desarrollo previo de las tecnologías de la nucleasas de dedos de zinc y de las nucleasas TALEN, que hemos mencionado arriba. Sin embargo, el diseño de estas nucleasas para conseguir un corte deseado en un sitio concreto del ADN se reveló tedioso e ineficaz.
¿Podría tal vez usarse a cas9 y a un RNA guía para cortar no ya el ADN de un virus en el interior de una bacteria, sino el ADN cromosómico en el interior de una célula eucariota, que lo guarda en su núcleo, empaquetado alrededor de proteínas en los cromosomas?
Aquí aparece otro protagonista de la historia, el emigrante chino a los Estados Unidos Feng Zhang. Feng se enamoró de la biología molecular muy joven y contribuyó al desarrollo de la tecnología TALEN. Cuando oyó de la existencia de CRISPR, en 2011, decidió trabajar para hacerla compatible en células eucariotas.
Para ello, optimizó la secuencia del gen cas9 de la bacteria Streptococcus thermophilus para que se pudiera producir mejor en células eucariotas y le añadió una secuencia de transporte nuclear, es decir, una secuencia de aminoácidos que permite el transporte de las proteínas que la tienen al núcleo. Esta secuencia es una manera que las células eucariotas emplean para organizar qué proteínas y enzimas deben ir al núcleo y cuáles deben quedarse en el citoplasma.
El Dr. Feng Zhang probó si su sistema funcionaba o no en células eucariotas y vio que sí, aunque era ineficiente. Durante el siguiente año, el Dr. Zhang se dedicó a optimizar este sistema probando cas9 de diferentes bacterias.
Finalmente, el Dr. Zhang pudo desarrollar un sistema eficiente basado en cas9 de la bacteria Streptococcus pyogenes, con el que pudo modificar 16 genes de manera específica. Su sistema tenía los tres componentes inicialmente necesarios cas9, crRNA y tracrRNA. Cuando apareció publicado el descubrimiento de Charpentier y Doudna, el Dr. Zhang probó en su sistema el sgRNA y vio que funcionaba si hacía una modificación simple para restaurar una estructura crítica en el RNA.
Zhang publicó sus hallazgos en Science en 2013. Su artículo se ha convertido en el más citado de este campo y sus reactivos han sido distribuidos libremente a más de 25.000 científicos de todo el mundo.

Presente y futuro

¿Qué ha conseguido ya esta tecnología y qué promete para el futuro?
Esta tecnología ha conseguido proporcionar una herramienta a los laboratorios de todo el mundo que permite manipular el genoma de las células con facilidad. Estas células pueden ser tumorales, inmortales, o células madre. Cualquier célula.
Las técnicas de transfección, electroporación o infección vírica permiten incorporar desde hace ya décadas ADN extraño a las células. Ahora se trata de incorporar ADN que contenga la información para generar el enzima cas 9 y que produzca el sgRNA de nuestra elección. De este modo, se produce el corte en el gen o genes que deseemos. Estos pueden ser genes de las células, pero también genes de retrovirus incorporados en el genoma, o genes de parásitos que nos atacan.
Pero ahora cortar el ADN no es todo lo que podemos hacer con esta tecnología. Se ha modificado cas9 de manera que no corte, pero se dirija al sitio al que le conduce el sgRNA. Esta cas9 modificada puede ser dirigida así a un promotor de un gen, al que va a apagar, pero de manera reversible, puesto que no lo corta. Cuando el sgRNA desaparezca o sea eliminado, el gen volverá a funcionar.
Igualmente cas9 se ha modificado para que lleve adjuntas proteínas que son factores de transcripción, los cuales activan el funcionamiento de los genes. En este caso, cuando llegue al gen de nuestra elección, guiada por el sgRNA, cas9 va a “encender” un gen o varios genes, que se podrán “apagar” eliminando el sgRNA.
La facilidad con la que se puede editar y controlar el funcionamiento del genoma y modificar varios genes al mismo tiempo no tiene parangón en la historia de la biología molecular. Esto proporciona una herramienta de investigación formidable que permitirá adquirir nuevo conocimiento sobre la función de los genes y proteínas y sobre las interacciones en las que están implicadas unos y otros. Esto conducirá a comprender mejor las causas de las enfermedades y tal vez a descubrir insospechados fenómenos que se ocultan en las profundidades celulares.
Proyectos de investigación que antes eran solo posibles en el ámbito de la ciencia-ficción, han pasado ahora a localizarse completamente en el ámbito de la ciencia.
Hace poco, hablamos de la posibilidad de curar la distrofia de Duchenne mediante la modificación genómica de células madre mediante esta técnica. Las posibilidades en este ámbito son muy extensas. Se pueden desarrollar estrategias para curar numerosas enfermedades genéticas, para acabar con microorganismos infecciosos, incluso para curar el cáncer.
Desde el punto de vista de la biotecnología, se hace ahora muy sencillo modificar genes en animales y plantas y no digamos ya en organismos unicelulares de interés económico. Se ha utilizado ya la tecnología CRISPR en levaduras, bacterias de la fermentación, gusanos, moscas, ratones, monos y humanos. Más de 20 especies han sido ya estudiadas con esta tecnología.
Un objetivo que CRISPR puede hacer posible es el de generar “genes egoístas” que se expanden rápidamente y pueden modificar poblaciones enteras de organismos perniciosos, como el mosquito de la malaria, o el del virus zika, ahora de actualidad.

¿Qué lecciones extraemos de esta historia?

Una vez más que los avances más insospechados aguardan ocultos en investigaciones que nada tienen que ver e sus inicios con el punto al que se llega finalmente.
Los que investigaron CRISPR inicialmente no perseguían editar el genoma curar enfermedades, o detener la expansión de poblaciones de mosquitos. Simplemente persiguieron su curiosidad o fueron motivados por otros objetivos que no lograron, como mejorar la fermentación láctica o impedir el bioterrorismo.
Otra lección es que los que más contribuyeron a este desarrollo científico lo hicieron en su juventud, cuando se tiene el impulso de avanzar en la carrera. Sin embargo, es cierto que sin la experiencia de quienes les dirigieron sus tesis y estancias postdoctorales, este logro no hubiera sido tampoco posible. La moraleja es que hay que dar libertad a los jóvenes científicos, pero también un sentido de la dirección.
Otra lección es que la ciencia se construye con el trabajo de todo el mundo, literalmente. Numerosos científicos en varios países, con gran esfuerzo y dedicación y con su porvenir nada claro, fueron capaces de construir todos juntos, el conocimiento y la tecnología. Ese gran momento eureka que se experimenta solo, parece ser ya cosa del pasado.
Otra lección es que los mayores avances de la Humanidad provienen de personas que dedican su esfuerzo a prepararse para la ciencia y no a jugar en bolsa o a especular en la famosa economía financiera. Estas personas, que no son necesariamente geniso ni más inteligentes que la media, no se harán nunca ricas, tal vez porque lo que son capaces de aportar al resto de la Humanidad no tiene precio.

Referencias
Lander ES (Jan 2016). “The Heroes of CRISPR”. Cell 164 (1-2): 18–28. doi:10.1016/j.cell.2015.12.041. PMID 26771483.

Wright AV, Nuñez JK, Doudna JA. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature’s Toolbox for Genome Engineering. Cell. 2016 Jan 14;164(1-2):29-44. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26771484

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